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实验笔记之ELISA实验常见问题解答
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA实验原理简单，步骤少，流程短，试剂盒操作相对简便，实验小白也能轻松上手。然而，实验上手虽快，想要得到可靠的实验结果，却并不那么容易。为了更好地助力科研实验，恒远生物在这里将大家关心的ELISA试剂盒实验的常见问题整理如下：
一、关于试剂盒：
1.你们的ELISA试剂盒能检测什么物种？
目前我们的试剂盒检测的种属主要为人、小鼠、大鼠、猴、兔、猪、鸡、植物等，种属齐全。如果试剂盒的命名带有特定指向（如人），代表专门针对此物种；没有指明物种，则代表该试剂盒在目前公司产品涉及的种属（例如人、小鼠、大鼠、猴、兔等）内通用；其他特殊种属的检测适用性，请联系技术支持确认。
2.96TELISA试剂盒能检测多少样本？是否需要做复孔？
为了保证实验结果的准确性，我们建议标准品和样品都做复孔，但并不强行要求ELISA实验一定要做复孔/3复孔，客户可根据自己的需求设定复孔实验，具体实验情况可咨询恒远生物技术指导。
3.需检测的样品较多，能否减少标曲的孔数？
为保证结果的准确度，不建议减少标曲的孔数，请确保能够检测至少6个不同的标准品浓度（含空白孔)。
4.ELISA试剂盒要使用多次，但样本较多，是否可以只做一次标曲？
虽然ELISA实验的操作步骤相同，但每次实验的各种影响因素都会有所变化。所以，每次实验时，都必须重新绘制标准曲线，以得到更准确可靠的检测结果。如果需要做多次实验，溶解后的最高浓度标准品可以分装保存于-20℃条件下，避免反复冻融，半个月内使用有效。
二、关于样本
1.血清血浆样本应该选用哪种真空采血管收集？
血清：不含抗凝剂的采血管/含促凝剂采血管（通常为红色、黄色、橘色管盖的采血管）
血浆：含抗凝剂的采血管（通常为绿色、紫色管盖的采血管）
样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃条件下；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃条件下（1个月内检测）或-80℃条件下（3个月内检测），避免反复冻融。检测前，应缓慢融化冷冻过的样本，并离心除去冻融过程中产生的沉淀物。
2. 采集时，如何尽可能避免溶血现象？
溶血可由多种理化因素和毒素引起。在体外，机械性强力振荡、低温冷冻等诱因均可引起溶血。为避免溶血对检测结果产生影响，应注意：
（1）静脉采血时，回抽压力不宜过大；
（2）一次性采血量不宜过少；
（3）采集的全血不宜激烈振荡；
（4）离心转速不宜过大；
（5）收集的全血需尽快处理成血清/血浆，全血不能冻融；
（6）若需要麻醉采血，需使用没有溶血作用的麻醉剂。
3.组织/细胞样本收集中提到的“反复冻融”，过程应该如何操作？
（1）组织样本：组织研磨后，将其-80℃放置1h/液氮放置0.5h，再置于30℃水浴锅中轻微振荡，使其迅速融化，反复操作1-2次即可；
（2）细胞样本：按上述操作步骤，反复冻融2-3次。若为膜蛋白，可以适当做超声处理，但需要控制好超声的温度、频率；
4.怎样判断我的样本是否需要稀释或做其他处理？
试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度，并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果是常规样本类型，可以咨询ELISA技术支持，以获取样本的推荐稀释倍数，并安排预实验检测；如果样品中待测物的浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩；如果样本中的分析物浓度远低于试剂盒的最低检测限，建议选择灵敏度更高的试剂盒来检测。