抗体常见问题之WB
| 问题 | 原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 条带形状不好看 | 胶凝的不均匀，聚合不好 | 灌胶前将溶液充分混匀 |
| 上样齿扭曲使上样孔大小不一 | 上样前用针头将齿拨正，注意不要将针头插入胶内 | |
| 某些样品盐浓度较高 | 除盐或将样品盐浓度调成一致 | |
| 每孔上样量不一致 | 调整上样量使基本一致 | |
| 缓冲液陈旧，成分改变 | 重配 | |
| 凝胶下面有气泡 | 电泳前先将气泡赶走 | |
| 电泳时温度过高 | 降低电流或电压 | |
| 目的蛋白信号弱 | 样品上样量不足或目的蛋白浓度过低 | 加大上样量或浓缩样品 |
| 转膜效率低 | 以下单列 | |
| 抗体浓度低 | 增加抗体浓度或延长孵育时间 | |
| 显色剂底物浓度不足 | 增加显色剂用量 | |
| 显色剂失效 | 更换显色剂（吸取A、B液的枪头不可混用） | |
| 显色或曝光时间不足 | 延长显色或曝光时间 | |
| 转膜效率低 | 转膜缓冲液pH值与目的蛋白等电点相近 | 提高转膜缓冲液pH值 |
| 凝胶与膜之间存在气泡 | 转膜前要排尽气泡 | |
| 凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触 | 滤纸、转印膜和凝胶大小要基本一致，避免滤纸直接接触 | |
| 转印膜种类选择不当 | 使用质量可靠的PVDF膜或硝酸纤维素膜 | |
| 电压或电流过小 | 湿转时20mA恒流，半干转时25V左右恒压 | |
| 转印时间过长或过短，蛋白还在凝胶中或穿透转印膜 | 先电泳，根据蛋白大小及转印装置选择合适的转印时间 | |
| 湿转过程中环境温度过高 | 使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度 | |
| 显色或曝光后无条带 | 胶与膜方向反了 | 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。 |
| 选用的一抗、二抗及显色方法不合适 | 选择合适的一抗、二抗和显色方法 | |
| 目的蛋白含量低于检测下限 | 加大上样量或浓缩样品 | |
| 抗体效价过低 | 增加抗体浓度 | |
| 抗体孵育时间不足 | 延长孵育时间，37°C孵育1小时以上 | |
| 抗体过度洗涤 | 减少洗涤时间及次数 | |
| 加入HRP底物反应与曝光检测之间间隔时间过长 | 反应3到5分钟及时检测 | |
| 背景过高 | 封闭物用量不足 | 提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜 |
| 封闭物使用不当 | 检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭 | |
| 封闭时间不够 | 室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜 | |
| 抗体非特异性结合 | 降低抗体浓度，减少孵育时间 | |
| 抗体浓度过高或洗涤不够 | 降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间 | |
| 化学显色底物过多 | 按说明书加入适量的显色底物 | |
| 杂带多 | 杂蛋白多 | 处理目的蛋白 |
| 抗体特异性不强 | 使用特异性强的抗体 | |
| 抗体孵育时间过久 | 减少抗体孵育时间 | |
| 二抗与抗原有交叉反应 | 选择合适的封闭物 | |
| 底物显色与曝光时间长了 | 缩短显色及曝光的时间 | |
| 大分子量WB | 膜孔径太小 | 更换孔径较大的膜 |
| 转膜电压电流低 | 提高电压/电流 | |
| 转膜时间短 | 延长转膜时间 | |
| 胶浓度太大 | 使用低浓度的胶 | |
| 转膜缓冲液配方不合适 | 调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度 |