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经验总结:细胞培养那些事
养细胞难、养原代细胞更难、养原代神经干细胞难上加难!这是科研界公认的事实，细胞培养是杂交瘤制备单克隆抗体过程中必不可少的实验操作，细胞培养是一个困难重重的事情，多少英雄都在细胞培养上自挂东南枝!
今天，恒远生物小编为大家详细总结原代神经干细胞取材及培养的那些事，手把手教你轻松搞定细胞培养的难题!
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
原代取材及培养
步骤一：原代取材
1.脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
2.将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
3.将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。重复2-3次。
4.细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
5.按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。2天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定)，经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器皿中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
步骤二：传代培养
1.在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。
2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液， 800r/min离心5min，弃上清。
3.加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF(添加谷氨酰胺)，调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。
实验影响因素
1.供体年龄的影响
实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经干数量明显高于新生鼠，且胎龄为12~15d左右的鼠胚胎体内的神经干的分化能力最强。
2.分离方法对细胞纯度及活力的影响
常用的细胞分离方法有机械分离法和酶消化分离法。机械分离法的缺点是吹力度和次数不易掌控，且机械切割作用会使细胞活性降低;酶消化法缺点是消化的时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞具有潜在的损害作用。
3.接种密度对神经干的影响
神经干细胞的适宜接种浓度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接种细胞密度过小，细胞不成球，不利于细胞增殖;接种细胞密度过大，第一次传代后很快出现死亡、特大、散乱、单细胞数迅速增多。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定,有利于细胞生长。
4.传代培养时机的影响
神经干细胞经过原代培养后中，细胞数量大量增殖，必将导致大部分神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是防止其死亡的关键，有文献报道一般选用原代培养5~7 d时进行，既可避免细胞过度增殖而死亡, 又保持细胞增殖的活性。
注意事项
1.为维持取材过程中的细胞活性，在取材整个过程中应都在冰上进行并且在剥离脑膜和血管组织中要在含有10%FBS高糖培养基中，因为胎鼠神经干代谢旺盛，长时间在无糖环境对神经干造成损伤。
2.在取材过程中，不要取一个皮层，剥离一个脑膜血管，而是快速将所有胎鼠皮层取下来，放到高糖培养基中。
3.剥离脑膜及血管应全部分离干净，否则在制作单细胞悬液时，会被迫加大吹打力量和次数，造成细胞损伤。
4.在培养过程中，为防止细胞贴壁分化，隔天轻轻晃动培养基。
5.避免细胞污染。加强无菌操作意识，做好实验室、实验器械等的消毒工作。
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